培養皿裡的「微」牧場

本文收錄於臺大農業推廣通訊雙月刊96期

文/國立臺灣大學生物科技研究所 宋麗英助理教授

隨著生物科技的發展日新月異,另類的牧場已然興起,結合現代生殖科技 (Reproductive biotechnology),包括:體外成熟 (in vitro maturation, IVM)、體外受精 (in vitro fertilization, IVF)、體外培養 (in vitro culture, IVC)、胚移殖 (embryo transfer, ET)、卵及胚的冷凍保存 (cryopreservation) 技術、精子與胚之性別控制及鑑定 (sperm or embryo sexing)、基因轉殖(transgenic)、體細胞核移置(somatic cell nuclear transfer, SCNT,又稱動物複製 animal cloning)等相關技術,在培養皿內發展分子牧場已是相關生技公司積極發展的業務之一。

以下就胚之體外生產 (in vitro production, IVP; IVP = IVM + IVF + IVC) 及其各相關技術進行簡介:

一、體外成熟

在乳業發達國家,當肉牛或乳牛淘汰後進入屠宰場,擷取大部分可供食用部份後,其內臟一般多作為動物飼料或為廢棄物,其中一部份─卵巢(約 5 至 7 公分大,如圖一所示),對屠宰場來說,可能是ㄧ個非常小而容易被忽略之組織,不仔細觀察,屠宰工人可能還沒發現它的存在,但對於繁殖生理學家,這可是異常珍貴,不可多得之研究材料。經吸取卵巢內之腔狀濾泡中未成熟卵母細胞,透過體外成熟培養的方式,可將其成熟至減數分裂中期 (metaphase II) 之熟卵母細胞(相當於體內排卵階段之卵母細胞),此時期之卵母細胞(或稱為卵子)即可提供進一步體外受精或體細胞核移置相關研究之用。

由屠宰場所收集的牛卵巢

圖一、由屠宰場所收集的牛卵巢,可將本來要當作廢棄物之卵巢,透過體外成熟培養, 將濾泡內之未成熟卵母細胞培養至成熟可用之成熟卵母細胞,讓「糞土」變「黃金」

牛的卵巢內在出生前就已增生到約 7 百萬個未成熟卵母細胞,出生後減到剩約 2 百萬個,當發育至發身 (puberty) 階段,卵巢內僅剩 10 至 20 萬個卵子,而牛的動情週期約 21 天左右,在其繁殖年齡中,頂多約 350 個卵子有機會被成熟排出,故終其一生,有超過99% 以上的卵母細胞是被浪費掉的,此時若施以體外成熟,將淘汰牛卵巢做最後的利用,即可大大增加其附加價值,化糞土為黃金。在乳業國家(如美國)即有生物科技公司見此商機,遂於屠宰場附近設立實驗室,自卵巢中收集卵丘─卵母細胞複合體(cumulus-oocyte comples,如圖二)包裝於經氣體平衡過之體外成熟培養液,放在可攜帶式之小培養箱內(僅提供溫控 39oC,無氣體供應),依客戶訂購之卵數,利用快遞公司(如:Fedex 或 UPS)由空運或陸運,於 20 至 24 小時之內即可運送到目的地實驗室,而卵母細胞即於運送過程中進行成熟,可供進行體外受精或核移置等相關試驗。圖三為經此過程成熟之卵母細胞,在卵的透明帶 (zona pellucida) 下,可見明顯之第一極體 (first polar body)。此等生物科技公司亦提供研究人員客製化的服務,如需乳牛卵巢(一般為經產牛較多,適用於產製乳牛胚胎之體外受精實驗)或肉牛卵巢(一般為母牛較多,卵品質較佳,適合進行核移置試驗),亦可依照需求供給,但此等經分類的卵子(稱為 sorted oocytes)則需支付較高之價錢,通常未分類者約 1.5 美元/卵子,經分類者約需 2 美元/卵子(攜帶式培養箱使用及運費另計)。一般一個卵巢平均可取出 8 至 10 個卵母細胞供體外培養之用。此等經由線上 (online) 或電話下訂單及客製化的服務,提供研究機構、相關科技公司或醫院等單位之研究人員非常便利管道,即可取得研究材料。

牛卵丘─卵母細胞複合體

圖二、自腔狀濾泡收集而得之品質優良的牛卵丘─卵母細胞複合體 (cumulus-oocyte complex),可見多層之卵丘細胞完整包覆在卵母細胞外圍

經體外培養之成熟的牛卵母細胞

圖三、經體外培養之成熟的牛卵母細胞,以玻尿酸酶配合玻璃微管,可將外圍包覆之卵丘細胞移除,此可進一步作為體細胞核移置之受核卵母細胞或供單一精子注射產製受精胚,若為一般體外受精,則必須保留完整之卵丘,以利受精順利進行,箭頭指處為成熟後所排出之第一極體

二、體外受精

一般多利用冷凍精液進行體外受精,通常一支冷凍精液若以傳統人工受精方式,僅能讓一頭母牛進行配種,若以體外受精方法,一支冷凍精液足可使 200 至 300 個體外成熟卵子受精,之後至少可獲得 50 個以上品質優良之囊胚,其價值馬上提升 50 倍以上,若以性別控制精液 (sexed semen) 進行受精,即精液經流式細胞儀分離後,僅篩選 X- 精子,以此進行體外受精,所得之胚胎即為單一性別之雌性胚胎,經胚移植後,酪農即可得到所希望性別之仔牛,勿須等待 280 天的懷孕期後始得知小牛為公或母,以此等方式產製牛胚,更能提升酪農之經濟效益。當然,因為屠宰場的環境,體外成熟來源的卵子無法針對個別牛隻進行系譜 (pedigree) 追蹤,故有機會導入不良的基因,亦無法進行矯正配種等措施。此外,因某些公牛精子對於流式細胞儀的分離過程特別敏感,故並非每頭公牛的精液都適合進行 X- 或 Y- 精子的分離;此外,分離後的精子活力降低,精子濃度變少,成本提高亦為製作性控精液需考量之處。但一般販售冷凍精液的公司會有一定的品質監控,市面上販售之性控精液一般可達相當之水準,然而,價錢勢必比未經性別分離之精液來得高。其他亦有利用 ovum pick up (OPU) 方法取得高產乳牛之體內成熟卵子與性控精液進行體外受精,不論是源自體內或體外成熟的卵子,利用體外受精方式,無疑大大增加單支精液的附加價值。圖四為冷凍精液解凍後之精子及其與卵丘─卵母細胞於體外受精培養液中共同培養,體外受精培養時間為 6 至 8 小時,於 39oC 培養箱,內含 5% 二氧化碳之溼潤空氣中進行受精。

牛體外授精之進行

圖四、牛體外授精之進行。左圖為解凍後之精子,右圖為精子與卵丘─卵母細胞於體外受精培養液中共同培養

三、體外培養

當體外受精完成後,即需將卵子移至體外培養液中培養,因體外受精液成分僅適合受精作用之進行,並不適合胚的生長發育。一般卵或胚的培養係於培養皿 (petri-dish) 內備製約 50 至 100 ul 培養液滴(每滴可放 20 至 25 的卵或胚),再覆蓋礦物油,置於內含 5% 二氧化碳,溼潤空氣之 39oC 培養箱內進行培養。牛胚體外培養時間一般歷時約七天,第二天發育到 8 細胞期,第四天約為桑葚期 (morula),第六天可見早期囊胚 (early blastocyst),第七天為擴張囊胚 (expend blastosyst),為相當於著床前 (pre-implantation) 的時期,此時胚即需進行胚移殖或冷凍保存。有數種常見的胚培養液,如 CR1aa, SOFaa 及 KSOMaa 等,牛的母源─胚源性基因轉換 (maternal-zygotic transition) 為 8 至 16 細胞期(約為受精後 44 至 48 小時),一般多以階段式培養系統 (serial medium) 進行,以 CR1aa 為例,受精卵於前兩天以牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 為主之培養液,於低氧 (5% O2, 5% CO2) 環境下進行培養,之後即換到以胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 為主之培養系統,於 5% 二氧化碳,一般大氣濃度 (20% O2 ) 並配合滋養層細胞 (feeder layers) 共培養至第七天(過程中換 1 至 2 次培養液),即可獲得著床前囊胚。圖五為胚胎操作技術人員在解剖顯微鏡下檢視胚發育狀況,並用嘴吸管連接適當口徑大小之玻璃管將發育停止之胚檢出,換上新鮮的培養液,以利胚之繼續發育。圖六為經體外培養至第七天的受精囊胚,經驗純熟之胚胎操作技術人員單一批次即可生產數百甚至上千的優質囊胚。ㄧ般而言,體外培養過程中為提高胚的發育率,多有血清及滋養層細胞共培養的使用,除了可能導致雄性胚比率提高(其生長一般較雌性胚快速),亦有胎兒過大之疑慮,恐於移植後導致難產,故應配合性控精液及特殊照護,以期順利得到所需性別之健康仔牛。

胚胎操作技術人員在解剖顯微鏡下檢視胚發育狀況

圖五、一般卵或胚的培養係於培養皿 (petri-dish) 內備製約 50 至 100 ul培養液滴,再覆蓋礦物油,置於溫控及適合氣體含量之培養箱內進行培養。上圖為胚胎操作技術人員在解剖顯微鏡下檢視胚發育狀況,並用嘴吸管連接適當口徑大小之玻璃管將發育停止之胚檢出,換上新鮮的培養液,以利胚之繼續發育

受精胚成長至擴囊胚階段

圖六、經 7 天的體外培養後,受精胚成長至擴囊胚階段 (expended blastocyst stage),品質優良的胚具緊緻的內細胞群(inner cell mass,如箭頭所示),其胚細胞數含量亦高

四、胚的冷凍保存技術

為延長胚保存期間,方便運輸及調整乳牛場生產時程,一般發育到第七天的囊胚將透過處理冷凍保護劑 (cryoprotectants),常用如:glycerol、 ethylene glycol(EG)、dimethyl sulfoxide(DMSO) 及 sucrose 等進行冷凍保存。冷凍保護劑在低溫下可保護細胞免於冷凍傷害,然而在常溫下,對細胞即具毒性,故操作過程需迅速確實,期於冷凍暨解凍後得到較佳之存活率。與傳統的慢速冷凍法 (slow freezing) 比較,玻璃化 (vitrification) 冷凍是為有效且冷凍復甦率更好的方法。一般玻璃化冷凍液含較高濃度之冷凍保護劑(如︰ㄧ般配方含 15% EG,15% DMSO 等),經迅速包裝完畢後,直接浸於 -196oC 之液氮內(以 500oC/秒速度下降),故操作得當,其胚與極少量之冷凍液瞬間冷凍成玻璃化狀,於胚細胞內或外皆無冰晶 (ice crystal) 之形成,此法不需額外儀器之購買,但需極為熟練之操作技巧,始可得較佳之存活率。胚之冷凍為配合胚移殖之進行,亦發展適於現場操作之配方與形式,透過一般現場的人工受精或胚移殖技術訓練過的獸醫或現場技術人員,即可行之。亦有生物科技公司為推廣其產品,設有冷凍胚暨胚移殖技術操作人員或與畜產試驗研究單位合作,利用輕便之行動實驗室(備有解剖顯微鏡,乾式液態氮筒等,如圖七所示)行走於酪農場間,幫助酪農進行冷凍胚的解凍及移殖服務。

冷凍胚服務行動實驗室

圖七、冷凍胚服務行動實驗室。一般胚操作技術人員至現場為酪農進行冷凍胚解凍及移殖服務時,備有可攜式解剖顯微鏡,乾式液態氮筒 (dry shipper) 及簡易之胚操作工具等,行走於酪農場間,幫助酪農進行冷凍胚的解凍及移殖服務

五、體細胞核移置(又稱動物複製)

自從 1997 年桃莉羊以成年體細胞經動物複製方法問世之後,至今已超過一打以上數量之哺乳動物以此法產製成功,包括:牛、山羊、豬、兔、騾、馬、鹿、水牛及駱駝…等。此將已分化之體細胞經去核卵母細胞質內含之物質經所謂再程序化 (reprogramming) 過程逆轉至相當於精卵受精後之早期胚時期(具全能性 totipotent 階段)的方法即稱為體細胞核移置 (somatic cell nuclear transfer, SCNT) 或動物複製 (animal cloning)。其方式為:1. 取成熟卵母細胞,以顯微操作之去核法 (enucleation) 移除位於卵母細胞內之單套 (1 n) 遺傳物質,並以此為受核卵母細胞 (recipient oocyte);2. 再將含有雙套 (2 n) 染色體之體細胞作為供核細胞(donor cell,透過血清飢餓培養方式,將供核細胞的細胞期調整為 G0/G1 期),利用顯微操作方式將供核細胞置入已去核之卵母細胞內;3. 再透過電融合 (electro-fusion) 方式,使供核細胞與受核卵母細胞之細胞質融合在一起,並利用化學或電激活 (activation),激活此重組胚(即仿精子受精時之條件),其後利用一般胚之體外培養方式使胚長成至囊胚期(如圖八);4. 再將此等複製囊胚經胚移殖方式移入經同期化之代理孕母子宮中,懷孕期滿即可獲得與供核細胞攜帶完全相同遺傳物質之複製子代。

複製孵化囊胚

圖八、經體細胞核移置後培養至第七天之複製孵化囊胚 (hatching blastocyst),此供核細胞係來自高產乳牛之卵丘細胞,透過體外生產系統配合動物複製技術,即可於短時間內產製大量高品質之囊胚供作胚移殖之用,一個品質優良的囊胚即代表其有高度潛力發展成為個體,透過此技術可快速產製優良種用之乳牛

於桃麗羊問世後,科學家旋即配合基因轉殖技術,產製帶有人類基因之複製牛,期透過乳腺為生物工廠 (bioreactor) 進行人類高價值醫療用蛋白之產製;此外,透過動物複製方式,高產乳牛或高價值肉牛(如日本和牛)品種,亦可以此法產製,甚至瀕臨絕種動物,亦可透過種間體細胞核移置方式 (interspecies somatic cell nuclear transfer) 進行複製保種。而 2008 年美國食品藥物管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 亦通過複製動物(健康且未經任何基因轉殖程序)所生產之乳品與肉品為安全無慮並可食用之畜產品。而其於再生醫學上,亦保有極大潛力生產「病人特異性之胚幹細胞」(patient-specific embryonic stem cell) 作為細胞治療或移植來源而不致產生免疫排斥 (immune rejection),然而因在人類應用上,發展此等胚幹細胞系需使用大量的卵源及破壞複製胚,故產生極大之道德爭議性與技術挑戰性。就動物模式而言,以動物複製為平臺進行基礎與應用研究,無疑提供最自然的管道了解再程序化的過程與機制,由此所得之知識進而可提供未來發展萬能幹細胞(或稱誘導幹細胞 induced pluripotent stem cell)最佳之自然導師。

六、結語

拜現代生殖科技之進步,人類幾乎扮演著動物註生娘娘的角色,甚或改變其一般存在的形式,如透過冷凍技術,遺傳物質可透過細胞系、冷凍精子、冷凍卵子、冷凍胚等形式於液態氮中長期保存;或透過基因轉殖及動物複製技術,產生攜帶人類基因之擬人化的家畜。故在培養皿內設立早期胚胎分子牧場已非天方夜譚,甚至還潛藏無限商機,其不僅對於發展中國家快速增進畜群之遺傳改進速率、提升畜牧業競爭力、甚或應用到人類不孕症治療、再生醫學與相關基礎研究皆扮演極為重要之角色。然而所有技術皆有其優缺點,如:高技術門檻、耗費人力與成本提高等,如何善用此等科技增進人類福祉,實乃為科學家共同努力目標。

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